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Fréquences des dinucléotides dans le génome d'organismes modèles

L'analyse de séquences est au cœur de nom­breux domaines de la bio-infor­ma­tique. Le billet du jour s'intéressera aux séquences ADN, en se pro­po­sant de comp­ter la fré­quence en dinu­cléo­tides dans quelques génomes d'organismes modèles (avec une petite arrière-pen­sée der­rière la tête).

Qu'est-ce qu'un dinucléotide ?

L'ADN double brins est clas­si­que­ment struc­tu­ré sous forme de double hélice, avec deux brins de direc­tion oppo­sée. À chaque posi­tion il y a deux acides nucléiques for­mant une paire, les appa­rie­ments clas­siques étant A en face de T et C en face de G. Ce qu'on appelle dinu­cléo­tide est une séquence de deux nucléo­tides suc­ces­sifs, à ne pas confondre avec une paire de nucléo­tide. Un petit sché­ma sera peut-être plus clair :

Figure 1: Séquence double brin GATTACA
Figure 1 : Séquence double brin GATTACA. En bleu : un dinu­cléo­tide. En rouge : une paire de base.

On peut aus­si dire qu'un dinu­cléo­tide est un k‑mer de lon­gueur (k) égale à 2.

Qu'est-ce que la fréquence en dinucléotide d'une séquence ?

Pre­nons par exemple cette séquence :

Figure 2: Séquence TGTG
Figure 2 : Séquence TGTG

Quels dinu­cléo­tides dénom­brez vous ? Je vous laisse deux phrases pour réflé­chir. C'est bon pour vous ?

On trouve deux fois le nucléo­tide TG (facile), et une fois le nucléo­tide GT (au milieu, peut-être l'avez-vous oublié ?). Donc pour une séquence de lon­gueur n, il y aura n‑1 dinu­cléo­tides. Ce qui donne une fré­quence de 2/​3 pour le dinu­cléo­tide TG et une fré­quence de 1/​3 pour le dinu­cléo­tide GT.

Mais est-ce bien tout ?

Et bien ça dépend. Si c'est un ADN simple brin, oui. Mais s'il s'agit d'un ADN double brin, sur­prise ! il y a d'autres dinu­cléo­tides cachés en des­sous !

Figure 3 : Il y a un ACAC caché sous le TGTG

Sous la séquence du haut, on trou­ve­ra donc deux dinu­cléo­tides CA et un dinu­cléo­tide AC (les dinu­cléo­tides sont lus et écrits dans le sens 5' vers 3' par conven­tion). Une séquence double brin de lon­gueur n aura donc 2n‑2 dinu­cléo­tides.

Cela nous don­ne­rait donc une fré­quence de 2/​6 pour les dinu­cléo­tides TG et CA, et un fré­quence de 1/​6 pour les dinu­cléo­tides GT et CA.

Pour une petite séquence, comp­ter à la main c'est fai­sable, mais dès que la séquence s’agrandit, autant le faire en uti­li­sant la *bio-infor­ma­tique* !

Calcul bio-informatique de la fréquence en dinucléotides avec R /​ Bioconductor

Je vous pro­pose d'utiliser des fonc­tions exis­tantes du package R /​ Bio­con­duc­tor Bios­trings. La séquence nucléique doit être pré­sen­tée sous la forme d'un objet DNAS­tring qui se crée via la fonc­tion DNAString(). On peut ensuite appli­quer la fonc­tion dinucleotideFrequency() avec ou sans le para­mètre as.prob = TRUE, en fonc­tion de si l'on sou­haite des comp­tages ou des fré­quences.

La fonc­tion dinucleotideFrequency() ne cal­cule que la fré­quence du brin ren­tré, et non la fré­quence du brin oppo­sé. Pour la cal­cu­ler, deux méthodes.

1) La méthode peu effi­cace mais simple : cal­cu­ler le conte­nu en dinu­cléo­tide du com­plé­ment inverse de la séquence et faire la moyenne des deux fré­quences :

2) La méthode effi­cace, mais deman­dant de coder un peu plus : réas­si­gner les fré­quences du brin + aux dinu­cléo­tides com­plé­men­taires inverses, ce qui évite de tout recal­cu­ler.

Voi­ci une petite fonc­tion pour cal­cu­ler la fré­quence en dinu­cléo­tide d'une séquence ADN double brins. J'en pro­fite pour faire un for­mat de sor­tie sous forme de tableau tidy pour nous sim­pli­fier la vie un peu plus tard.

Fréquence en dinucléotides du génome de référence de la drosophile

Main­te­nant que nous savons cal­cu­ler à la fois pra­ti­que­ment et théo­ri­que­ment la fré­quence en dinu­cléo­tides d'une séquence, atta­quons nous à un orga­nisme modèle, au hasard le génome de la drop­so­phile.

Le génome de la plu­part des espèces modèles est déjà dis­po­nible sous forme d'objets BSge­nome dans Bio­con­duc­tor, mais pour être plus géné­rique ici je fais un import direc­te­ment depuis le fichier fas­ta du génome de réfé­rence Ensem­bl.

On tombe là sur un pre­mier os. Il n'y a pas une séquence dans le génome de la dro­so­phile, mais 1870 séquences ! Cinq auto­somes, 2 chro­mo­somes sexuels, un chro­mo­some mito­chon­drial, et tout un tas de contigs non assem­blés. Il nous faut donc modi­fier légè­re­ment notre fonc­tion d'origine pour qu'elle fonc­tionne bien avec ce genre d'objets (des DNAS­tring­Set et non de simple DNAS­tring) :

Figure 4 : Fréquences dinucléotidiques du génome de référence de la Drosophile
Figure 4 : Fré­quences dinu­cléo­ti­diques du génome de réfé­rence de la Dro­so­phile

Comme on peut le voir, tout les dinu­cléo­tides n'ont pas la même fré­quence. Mais est-ce un résul­tat atten­du ? Ou pour refor­mu­ler la ques­tion, quel est la fré­quence atten­due pour chaque dinu­cléo­tide ?

Fréquence observée, fréquence théorique

Comme il y a 16 dinu­cléo­tides pos­sibles, on pour­rait s'attendre à ce que chaque dinu­cléo­tide soit obser­vé avec une fré­quence de 1/​16 (soit 6,25%). Ce serait le cas si les nucléo­tides simples avaient une fré­quence d'un quart. Hors ce n'est pas le cas en pra­tique ! S'il y a bien autant de A que de T et autant de C que de G, le conte­nu en G+C d'un génome peut varier énor­mé­ment d'une espèce à l'autre (C'est d'ailleurs uti­li­sé pour véri­fier les pure­tés d'assemblages, voir par exemple les Blob­Plots) !

On peut donc cal­cu­ler de manière un peu plus fine la fré­quence théo­rique d'un dinu­cléo­tide (TA par exemple, noté p(TA) ) comme la pro­ba­bi­li­té d'avoir un T en pre­mier ( p(T) ) mul­ti­plié par la pro­ba­bi­li­té d'avoir un A en second ( p(A) ), où p(T) et p(A) cor­res­pondent à la fré­quence en nucléo­tide A et T de la séquence étu­diée :

p(AT) = p(A) x p(T)

Ou de manière plus géné­rique :

p(N1N2) = p(N1) x p(N2)

On peut uti­li­ser la fonc­tion alphabetFrequency() de Bios­trings pour obte­nir les fré­quences de chaque nucléo­tide, et ensuite il s'agit de tout faire fonc­tion­ner ensemble. Par exemple, et sans détailler :

Ce qui donne :

Figure 5 : Fré­quences dinu­cléo­ti­diques obser­vées et atten­dues du génome de réfé­rence de la Dro­so­phile

Il y a donc plus de AA et TT qu'attendu dans le génome de la dro­so­phile ! On pour­rait tes­ter sta­tis­ti­que­ment cette dif­fé­rence, avec par exemple un test du chi2, mais il y a tel­le­ment de nucléo­tides que la p‑value retour­née est scan­da­leu­se­ment petite.

Fréquence en dinucléotides du génome de plusieurs espèces modèles

Il ne reste plus qu'à faire tour­ner ces fonc­tions sur les génomes de quelques espèces modèles popu­laires (en étant rai­son­nable avec l'API d'Ensembl lors de la récu­pé­ra­tion des génomes de réfé­rences), et voi­là :

Figure 6 : Fré­quences en dinu­cléo­tides des génomes d’espèces modèles en bio­lo­gie.

Les plus obser­va­teurs et obser­va­trices d’entre vous remar­que­ront peut-être la dis­pa­ri­tion des dinu­cléo­tides CG dans les génomes des ver­té­brés. Ce mys­tère pour­ra faire l'objet d'un pro­chain billet si la demande se fait pres­sante.

Remerciements

Mille mer­cis à mes relec­teurs et relec­trices Sébas­tien Gra­dit, Sarah Guin­chard, Vir­gi­nie J, et à nos admins ché­ries !




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