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DNase-seq, FAIRE-seq, ChIP-seq, trois outils d'analyse de la régulation de l'expression des gènes

ADN extrait de Cliococca selaginoides (Josh*m, CC BY-NC-SA)
ADN extrait de Clio­coc­ca sela­gi­noides (Josh*m, CC BY-NC-SA)

La régu­la­tion de la trans­crip­tion est un pro­ces­sus indis­pen­sable aux cel­lules pour per­mettre leur dif­fé­ren­cia­tion, expri­mer leur spé­ci­fi­ci­té, assu­rer leur déve­lop­pe­ment, leur pro­li­fé­ra­tion ou encore pour leur per­mettre de s'adapter à un envi­ron­ne­ment. L'étude de la régu­la­tion de la trans­crip­tion passe par l'identification d'éléments clés gou­ver­nant ces pro­ces­sus bio­lo­giques.
Ces élé­ments de régu­la­tions se dis­tinguent en deux groupes : les régions cis-régu­la­trices (région de l'ADN ayant la par­ti­cu­la­ri­té de contrô­ler l'expression de gènes plus ou moins éloi­gnés), et les élé­ments trans (pro­téines de liai­son à l'ADN recon­nais­sant la plu­part du temps les séquences cis).

L'apparition des tech­no­lo­gies de séquen­çage haut débit a bou­le­ver­sé notre manière d'étudier le génome et son expres­sion. Le cou­plage des méthodes de bio­lo­gie molé­cu­laire et du séquen­çage a per­mis l'émergence de nou­veaux outils per­met­tant d'analyser fine­ment et à l'échelle d'un génome entier l'expression et la régu­la­tion des gènes. Dans cet article nous allons nous inté­res­ser à trois de ces tech­niques : DNase-seq, FAIRE-seq et ChIP-seq.

DNase-seq

Principe de la DNase-seq (adaptation de  Zeng & Mortazavi, 2012)
Prin­cipe de la DNase-seq (adap­ta­tion de Zeng
& Mor­ta­za­vi, 2012)

La tech­nique de DNase-seq uti­lise un prin­cipe connu des élé­ments actifs de l'ADN (pro­mo­teurs, élé­ments cis …) qui est que ces régions sont plus acces­sibles à l'enzyme DNase I que le reste du génome. DNase-seq consiste à mesu­rer la dis­tri­bu­tion des cli­vages de la DNase I pour iden­ti­fier les régions décon­den­sées de l'ADN conte­nant des élé­ments régu­la­teurs de la trans­crip­tion.

Comme la figure le montre, l'ADN, une fois extrait des cel­lules d’intérêt, est mis en pré­sence d'une quan­ti­té opti­male de DNase I afin qu'elle clive l'ADN aux endroits où celui-ci n'est pas conden­sé. Les frag­ments d'ADN obte­nus sont ensuite puri­fiés afin d'éliminer les pro­téines de liai­sons qui peuvent sub­sis­ter. On a alors à ce stade récu­pé­ré toutes les por­tions d'ADN décon­den­sé du génome. Vient ensuite l'étape du mar­quage de ces frag­ments qui va per­mettre leur ampli­fi­ca­tion par PCR et leur iden­ti­fi­ca­tion, puis le séquen­çage haut débit. Les séquences obte­nues sont enfin ali­gnées sur le génome de réfé­rence et leur fré­quence est ana­ly­sée pour iden­ti­fier les régions régu­la­trices.

FAIRE-seq

Principe du FAIRE-seq (adaptation de Giresi & al., 2007)
Prin­cipe du FAIRE-seq (adap­ta­tion de Gire­si & al., 2007)

Le FAIRE-seq est en quelque sorte une ver­sion alter­na­tive du DNase-seq. Cette tech­nique se base éga­le­ment sur le fait qu'une région de l'ADN non conden­sée cor­res­pond à une région régu­la­trice de la trans­crip­tion. Le FAIRE, pour For­mal­de­hyde-Assis­ted Iso­la­tion of Regu­la­to­ry Ele­ments, comme son nom l'indique, uti­lise le for­mal­dé­hyde pour fixer la chro­ma­tine et toute autre pro­téine de liai­son in vivo. En effet, le for­mal­dé­hyde va lier les pro­téines à l'ADN par des liai­sons cova­lentes, ce qui va en quelque sorte séques­trer cet ADN lors de la puri­fi­ca­tion. On frag­mente ensuite l'ADN par soni­ca­tion (uti­li­sa­tion des ultra­sons pour rompre des molé­cules), et on le puri­fie avec une solu­tion de phé­nol-chlo­ro­forme. L'ADN non lié à des pro­téines se retrouve ain­si dans la phase aqueuse du mélange et peut ain­si être pré­le­vé et pré­pa­ré pour le séquen­çage, tan­dis que l'ADN lié aux pro­téines reste pié­gé dans la phase orga­nique. Enfin, comme pour le DNase-seq, l'ADN est extrait, mar­qué, ampli­fié et séquen­cé.

Le pro­to­cole du FAIRE-seq est plus simple que celui du DNase-seq tout en ayant des résul­tats tout aus­si pré­cis. On note­ra tout de même que le FAIRE-seq détecte avec une meilleure sen­si­bi­li­té les élé­ments régu­la­teurs dis­tants mais manque des pro­mo­teurs qui sont eux détec­tés par le DNase-seq.

ChIP-seq

ChIP-seq
Prin­cipe du ChIP-seq

Contrai­re­ment aux deux méthodes pré­cé­dentes le ChIP-seq, pour Chro­ma­tin Immu­no­pre­ci­pi­ta­tion sequen­cing, est uti­li­sé pour  iden­ti­fier les sites de fixa­tion d'une seule pro­téine asso­ciée à l'ADN. En ciblant une pro­téine par­ti­cu­lière avec un anti­corps spé­ci­fique, il devient pos­sible de cibler l'analyse que l'on veut mettre en place. En effet, si l'on veut dres­ser une carte de la chro­ma­tine, il faut choi­sir un anti­corps his­tone-spé­ci­fique. On obtien­dra alors l'exact oppo­sé des DNAse-seq et FAIRE-seq, à savoir des reads cou­vrant l'ADN conden­sé et non l'inverse. Il est éga­le­ment pos­sible de cibler un fac­teur de trans­crip­tion ou tout autre type de pro­téines de liai­son.

Le pro­to­cole est assez proche de celui du FAIRE-seq. L'ADN est fixé aux pro­téines avec du for­mal­dé­hyde in vivo, puis est frag­men­té par soni­fi­ca­tion. Ensuite des billes cou­plées à un anti­corps spé­ci­fiques cap­turent les pro­téines d’intérêt et l'ADN qui y est fixé. Cet ADN est ensuite extrait, puri­fié, mar­qué, ampli­fié et séquen­cé.

Pour aller plus loin

Acqué­rir de telles don­nées est une chose, mais uti­li­ser ces don­nées et en tirer quelque chose en est une autre. Alors, que faire une fois que nous avons iden­ti­fier des régions can­di­dates à la régu­la­tion de la trans­crip­tion ? Une des piste est de cher­cher dans ces régions des motifs connus d'éléments cis, autre­ment dit, des séquences recon­nues par des fac­teurs de trans­crip­tion. Pour cela, il existe des bases de don­nées comme par exemple ChIP­Base, qui pro­pose tout un arse­nal de don­nées rela­tives aux ChIP-seq évi­dem­ment, mais aus­si aux sites de recon­nais­sances de fac­teurs de trans­crip­tion pour six orga­nismes. Une fois qu'on a iden­ti­fié nos régions et nos fac­teurs, il nous faut décou­vrir quels gènes ils régulent, puis enfin recons­truire le réseau de régu­la­tion. Bref, il y a de quoi s'amuser pour un bon moment 🙂

Références :

Mer­ci à  Nisaea, Yoann M. et nal­lias pour leur relec­ture.

Cré­dit image : Isa­belle Sté­vant, licence Art Libre.

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Commentaires

5 réponses à “DNase-seq, FAIRE-seq, ChIP-seq, trois outils d'analyse de la régulation de l'expression des gènes”

  1. Article inté­res­sant, mer­ci. Cepen­dant, il faut tout de même faire atten­tion. Une région ouverte (libre de nucléo­some cap­tu­rée par DNase-Seq ou FAIRE-seq par exemple) ne veut pas for­cé­ment dire région régu­la­trice ! De même, une région où un fac­teur de trans­crip­tion se lie n'est pas for­cé­ment fonc­tion­nelle. Ce sont de bons indi­ca­teurs mais ce n'est pas abso­lu.

    1. En effet, ça reste des indi­ca­teurs. J'ai aus­si bien conscience qu'une fixa­tion d'un fac­teur de trans­crip­tion n'est pas for­ce­ment fonc­tion­nelle. Un recou­pe­ment avec des don­nées d'expression comme le RNA-seq per­met­tra ensuite de mettre en évi­dence les régions et fixa­tions "réel­le­ment" régu­la­trices.

      Je ne suis pas une experte dans ce domaine, je débute à peine ma thèse et je vais être ame­née à mettre en place ces expé­riences d'ici peu.

      Si vous avez des pré­ci­sions à appor­ter n'hésitez pas, je n'ai fait que sur­vo­ler le sujet ^^

  2. Très inté­res­sant, mer­ci. Pour moi qui ne tra­vaille pas sur ces ques­tions, ce rapide résu­mé com­pa­ra­tif est très utile. 🙂

  3. Très bon article, com­plet et didac­tique. Atten­tion tou­te­fois à ne pas oublier que, comme toutes les méthodes glo­bales, ces ana­lyses demandent des vali­da­tions avec des tech­niques com­plé­men­taires ; en l'occurrence ici, du ChIP tra­di­tion­nel. Cette notion est par­ti­cu­liè­re­ment impor­tante car opti­mi­ser des vali­da­tions dans des condi­tions dif­fé­rentes de l'analyse glo­bale est par­fois extrê­me­ment dif­fi­cile. Par­fois même, la vali­da­tion donne le contraire de l'analyse glo­bale…

  4. Bon­soir, les infor­ma­tions sont concises et inté­res­santes.
    Bien à vous.

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