Découverte :
Le séquençage, une histoire de générations

L'ADN (Acide DésoxyriboNucléique) est une molécule présente dans toutes les cellules des êtres vivants. Elle renferme l'information nécessaire pour se développer et se reproduire. L'information en elle-même est codée par la suite de quatre différents acides nucléiques ordonnés d'une façon compréhensible pour l'organisme.

Décrypter cette information est un enjeu majeur pour la recherche scientifique. Il aide à mieux comprendre et appréhender le fonctionnement des êtres vivants, comprendre certaines maladies et par conséquent les soigner. C'est aussi son décodage qui a permis l'essor de la phylogénie moderne.

Le séquençage est  le processus utilisé pour la découverte de cette séquence. Plusieurs méthodes existent, se développent et s'améliorent toujours plus avec le temps. Nous en sommes aujourd'hui à la 3ème génération de ces outils de séquençage.

Cet article a pour but de vous présenter un bref aperçu de ces trois générations d'outils et de vous guider vers des articles scientifiques plus complets si vous désirez en savoir plus.

Première génération

Développée par Sanger  en 1975-77 ([1] et [2]) une étape d'amplification génère des fragments d'ADN de différentes longueurs. Chaque fragment se termine par un fluorochrome spécifique, signature d'une des bases. Les fragments sont ensuite traités par électrophorèse. Ceux-ci se regroupent et s'ordonnent en fonction de leur longueur. La séquence des couleurs ainsi lue est alors utilisée pour transcrire le fragment dans son ensemble.

Il faut noter qu'une autre méthode, chimique, a été proposée par Maxam et Gilbert en 1977 et n'a pas été retenue, plus complexe et difficile à mettre en place, ne résistant pas au passage à l'industrie ([3]).

Pour de plus amples informations sur la première génération d'outil de séquençage, vous pouvez vous diriger vers cet article ou/et celui-ci.

Seconde génération

La seconde génération d'outils de séquençage est apparue en 2005 en réponse au prix élevé et au faible débit du séquençage de première génération. Ici, des dizaines de milliers de séquences sont traitées ensemble, en parallèle. C'est l'apparition du séquençage haut-débit. Le "high throughput sequencing" ou encore le "next-generation sequencing" sont les termes les plus utilisés pour en parler. Il existe de nombreuses techniques, développées par différentes entités dont les principales sont Roche, Illumina et  Life Technologies mais toutes ont la même philosophie, c'est à dire :

• Amplification de l'ADN  principalement via PCR par émulsion (emPCR) ou par PCR par phase solide (solid- phase amplification).
• Succession de cycles de lavage et identification ("wash & scan" ) : incorporation de nucléotides dans la chambre de réaction, lavage de la chambre de réaction, capture de l'image.

 

Pour plus d'informations sur le "next generation sequencing" , je vous invite à lire cette revue assez complète, détaillant les technologies utilisées, et comparant les différentes plates-formes de séquençage existantes.

Entre les deux : Ion torrent et Helicos Genetic Analysis System

Ion Torrent ( de Life technologies) est une méthode qui se situe entre la 2eme et 3eme génération d'outil de séquençage. Bien que celle-ci procède de la même façon au niveau de l'amplification de l'ADN et des cycles de "wash-&-scan" , Ion Torrent  supprime le besoin de lumière et de caméras pour étudier la séquence. A la place Ion torrent mesure le largage d'un hydrogène lors de l'incorporation d'une base dans le brin d'ADN. Le décryptage est alors facilité, cela réduit nettement la durée du séquençage et améliore son efficacité.

Helicos Genetic Analysis System (de Helicos BioScience) se rapproche de la troisième génération par le fait qu'il n'y a qu'une seule molécule à séquencer. Pourtant, un coût élevé et des cycles d'arrêt toujours nécessaires ne permettent pas à ce système de faire partie de la troisième génération.

 Troisième génération

La troisième génération de séquençage de masse est symbolisée par le séquençage d'une seule molécule d'ADN (SMS ou "Single Molecule Sequencing" en anglais).

Contrairement à la seconde génération,  aucune amplification de l'ADN (ou ARN) n'est nécessaire pour effectuer les mesures. Une seule molécule est "lue".

Plusieurs technologies et méthodes sont ici à l’œuvre, avec chacune des avantages et des inconvénients. Elle peuvent grossièrement être classées en trois catégories :

• Séquençage par synthèse, observation de l'ADN polymérase à mesure qu'elle synthétise le brin d'ADN.
• Détection des bases les unes après les autres au fur et à mesure que la séquence d'ADN passe à travers un nanopore.
• Observation directe de la molécule d'ADN en utilisant des techniques de microscopie.

Je vous redirige sur cet article si vous voulez en savoir plus.

Comparaison

Ce tableau présente les principales différences entre les trois générations d'outils de séquençage haut-débit et présente les améliorations que promet la 3ème génération d'outils de séquençage.

 

 

Nous observons donc que la 3ème génération tente de réunir les avantages des deux premières générations, à savoir des séquences lues plus longues, un temps de séquençage assez court, une résolution et précision élevées et un volume de données important. Elle réussit assez bien, cependant le taux d'erreur du séquençage reste assez élevé (>5%) et la technologie utilisée pose encore beaucoup de problèmes au niveau des insertions/délétions. La troisième génération n'est donc pas encore prête à détrôner complètement le "next-generation sequencing" .
Il faut aussi retenir que certaines techniques permettent d'obtenir la cinétique d'incorporation des bases, ce qui permettra de comprendre des systèmes encore plus complexes comme les patterns (patrons) de méthylation de l'ADN par exemple, faisant avancer la recherche scientifique.

Références :

A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. F. Sanger et al.(lien)

DNA sequencing with chain-terminating inhibitors F. Sanger et al.(lien)

 A new method for sequencing DNA. A M Maxam et al. (lien)

 Emerging technologies in DNA sequencing. Michael L. Metzker (lien)

DNA sequencing: bench to bedside and beyond. Clyde A. Hutchison (lien)

Transforming single DNA molecules into fluorescent magnetic particles for detection and enumeration of genetic variations. Devin Dressman et al.(lien)

Solid phase DNA amplification: characterisation of primer attachment and amplification mechanisms. Céline Adessi et al. (lien)

Sequencing technologies — the next generation. Michael L. Metzker (lien)

A window into third-generation sequencing. Eric E. Schadt et al (lien)

Images :

Toutes les images, exceptée la première (libre de droit) proviennent de cet article en Open Access.

 

Merci à Clémentine , Benjamin , Aurélien  et Yoann pour les commentaires et discussions lors de l’édition de cet article.