En ces temps hivernaux, virus et infections bactériennes sont de retour (pour vous jouer un mauvais tour...). Les campagnes de prévention et de soin sont donc de sortie, et parmi elles la célèbre : "Les antibiotiques, c'est pas automatique". Si ce slogan est bien rentré dans la tête des gens, la raison pour laquelle il a été édicté l'est moins. Je vous propose donc d'explorer celle-ci à travers le spectre bio-informatique !

 

1. Au commencement, il n'y avait que des mauvaises habitudes...

Les premiers antibiotiques purifiés sont apparus dans le panel de soin entre les deux guerres mondiales (avant cela, ils existaient sous forme in situ [1] ou servaient juste à saboter les expériences du voisin de paillasse Fleming [2]). La famille des sulfamides a été la première à être découverte, et s'en sont suivi d'autres avec actuellement plus de 10 000 molécules comptabilisées. Cependant, seul 150 environ sont utilisables en thérapeutique humaine [3] en raison de problème de toxicité, biodisponibilité, etc. L'introduction des antibiotiques modernes, conjointement à la vaccination (souche d'origine bactérienne) et des normes d'hygiènes, a permis de faire chuter la mortalité due aux infections bactériennes (tant humaines qu'animales). Mais contrairement à la vaccination, l'efficacité des antibiotiques n'est pas garantie sur toutes les souches et surtout va tendre à diminuer dans les années à venir.

 

La raison, c'est l'antibiorésistance. Si elle a toujours existé (les bactéries ne nous ont pas attendus pour se faire de la compétition environnementale à coup d'antibios de leur cru), elle s'est accélérée avec l'emploi massif par l'humain. De plus en plus de bactéries ont peu à peu été capable de contrer l'efficacité des antibiotiques, et cela notamment en raison d'une utilisation dommageable :

• Utilisation contre des virus *
• Utilisation contre de mauvaises souches
• Arrêt prématuré des traitements avant leur terme
• Utilisation préventive, principalement dans les élevages industriels d'animaux pour éviter la propagation d'une souche et donc l'abattage de tous les animaux
• Contamination d'environnements extérieurs par des résidus non traités (rivières, terres, etc.) [4]

C'est dans ces 2 premiers cas que le slogan "Les antibiotiques, c'est pas automatique" (créé par la CNAM en 2002 [5]) prend son sens. Le souhait était d'alerter la population sur l'antibiorésistance sans la nommer, afin que les gens cessent de réclamer des antibiotiques dans des cas inadaptés, et que les praticiens cessent de les prescrire par réflexe. Fait amusant : en 2018 on a d'ailleurs eu le droit à une mise à jour de ce slogan avec "Les antibiotiques sont précieux, utilisons-les mieux" [6] qui traduit mieux l'idée d'une utilisation sélective et raisonnée.

* Hors cas de surinfection bactérienne, et hors cas extrêmement particuliers (ex : Ebola [7], Hépatite D [8], etc.)

Et si on insiste autant sur le sujet, c'est qu'il y a urgence. De plus en plus de bactéries acquièrent des résistances et ce de plus en plus rapidement. Hors on peine à trouver de nouveaux antibiotiques qui pourrons contrer ces nouvelles bactéries parfois multi-résistantes.

 

2. Les principes de la résistance

On distingue une variété de mécanismes développés par les bactéries pour se protéger du mécanisme d'action (lui-même varié) des antibiotiques :

• La production d'une enzyme inhibant l'agent antimicrobien
• La mutation et/ou modification (post-traductionnelle par ex.) de la cible d'un agent antimicrobien pour diminuer sa fixation
• La réduction de la perméabilité membranaire
• L'efflux (pompage vers l'extérieur de la membrane cellulaire) de l'agent antimicrobien
• La réduction de l'impact de l'agent antimicrobien sur le métabolisme cellulaire (par modification d'une voie métabolique ou la surproduction du composé impacté par l'agent antimicrobien)

Si certaines bactéries en possèdent de façon native, la plupart d'entre elles l'acquièrent au cours du temps et à force de contact avec l'antibiotique et son agent antimicrobien. On distingue deux groupes de processus d'acquisition :

• Le transfert vertical : mutation du chromosome ou d'un/de plasmide(s) (spontanément ou par agent mutagène), puis sélection de la résistance
• Le transfert horizontal : échange de gènes entre souches d'une même espèce, voire entre espèces (par conjugaison, transduction ou transformation)

Note : Si l'acquisition de résistance antibiotique par transfert horizontal reste rare proportionnellement au transfert vertical, elle n'en reste pas moins suffisamment fréquent pour propager rapidement une résistance mature [9].

 

3. Et la bioinfo dans tout ça ?

La démocratisation du séquençage (non, je ne remettrai pas ce graphique que tout le monde connaît) a permis de séquencer à tout-va ce qui nous passe sous la main. Le séquençage 16S, le whole-genome-NGS, et le mNGS (schéma comparatif des techniques) en ont profité et se sont ainsi invités dans bon nombre d'équipes travaillant sur des maladies infectieuses, avec différentes problématiques explorées.

L'adaptation du traitement antibiotique à la souche

Dans le cas le plus classique d'infection bactérienne nécessitant un traitement antibiotique, les médecins possèdent des traitements standardisés (selon le patient, les symptômes, situation épidémiologique des maladies infectieuses, etc.). On les dit de "première intention" et ils fonctionnent la plupart du temps [10]. Cependant il arrive qu'ils ne soient pas ou peu efficaces en raison d'une mauvaise supposition de la souche et/ou d'une souche résistante. Afin d'adapter l'antibiotique, il était donc auparavant nécessaire de faire effectuer une culture bactérienne et des analyses telles qu'un antibiogramme, une galerie d'identification biochimique, etc. Cette démarche nécessitant une culture bactérienne (minimum 24/48h) + un temps d'analyse certain, elle obligeait au mieux à faire revenir le patient quelques jours après pour la prescription de l'antibiotique adapté, au pire à faire prescrire des antibiotiques dits de "seconde intention". Cette dernière opération réservée aux infections sévères (donc le plus souvent prises en charge à l'hôpital) présente toutefois le risque d'avoir encore une fois un antibiotique inefficace (engendrant potentiellement la mort du patient) et le risque de la création d'une nouvelle souche multirésistante.

Face à ces contraintes de temps parfois trop importantes au vu de l'état de santé d'un patient, le séquençage et l'analyse d'échantillons via des pipelines standardisés sont une solution [11]. On retrouve ainsi les technologies MinION et MiSeq ainsi que leurs pipelines respectifs, MetaPORE [12] et SURPI [13], mais aussi des outils indépendants tels que Kraken [14] ou Taxonomer [15].

 

 

Mais finalement, tous reposent approximativement sur le même enchaînement :

1. 1. Une partie wet lab
      1. Extraction des acides nucléiques, ADN ou ARN (dans ce cas on aura en plus les étapes menant jusqu'à l'ADNc)
      2. Préparation des librairies de séquençage
      3. Accroche des amorces
      4. Séquençage
   2. Une partie dry lab
      1. Détection des reads (fragments)
      2. Filtrage des reads humains
      3. Alignement sur une base de données de référence
      4. Classification taxonomique
      5. Identification microbienne

Note : Si vous souhaitez avec une review complète (dont je ne peux malheureusement pas vous partager la superbe table 1 ici en raison de sa licence restrictive), je vous suggère fortement la lecture de Clinical Metagenomic Next-Generation Sequencing for Pathogen Detection

 

Cependant il faut contraster l'emploi de ces techniques avec la réalité. En effet, la limite de détection selon la concentration d'une souche, l’interférence de substances moléculaires lors de l'extraction des acides nucléiques, la contamination, la disponibilité dans les fluides corporels, etc. sont autant de paramètres à prendre en compte pour la caractérisation de souches pathogènes pour un diagnostic.

 

Identification et prédiction des résistances

En complémentarité avec la problématique précédente, la création de bases de données de référence sur les gènes de résistance, et surtout leur mise à jour constante face à l’évolution rapide de ceux-ci, représente un véritable challenge. On retrouve ainsi deux grands types de bases de données (de façon semblable à celles des facteurs de transcription) : celles curées manuellement par des spécialistes et/ou validées expérimentalement, et celles avec des résistances obtenues selon des prédictions.

 

 

La prédiction des gènes liés à l'antibiorésistance se base sur plusieurs techniques :

• La comparaison de génomes de souches ancestrales et évoluées afin de définir les motifs de changements génétiques opérant au cours du temps
• L'étude de l'évolution parallèle de souches pour distinguer les mutations adaptatives de mutation neutres ou délétères.
• L'étude phylogénique pour comprendre  la sélection et la transmission de gènes de résistance
• Le calcul de l'impact phénotypique des mutations avec notamment les coûts adaptatifs (énergie dépensée pour la production de la résistance contre survie)
• etc. [16]

Les prédictions font toutefois preuve de limitations sur les types de résistance qu'elles peuvent détecter ainsi que sur la fiabilité de qualification de gène de résistance quand ceux-ci sont simultanément des house keeping genes (gènes domestique) [17].

 

Conclusion

Les technologies de séquençage et pipelines d'analyse font à présent partie de la trousse d'outils à disposition des médecins, des épidémiologistes et des chercheurs en microbiologie bactérienne. Si dans le cas des premiers leur utilisation est ponctuelle pour l'instant (en raison du rapport coût/bénéfice), ils sont déjà bien exploités dans le cas des deux derniers. Avec l'évolution et l'engouement pour la métagénomique actuelle, on attend de voir les prochaines applications qui pourront servir l'étude de l'antibiorésistance.

Je vous laisse avec ce comic d'xkcd très à propos.

 

 

Merci à Mathurin, Yo M, et Guillaume Devailly (auteur de la suggestion du xkcd) pour leur relecture sur cet article !

 

Sources

• [1] L'utilisation rudimentaire de la pénicilline avant sa "découverte"
• [2] La "découverte" de la pénicilline par Alexander Fleming
• [3] Les familles d'antibiotiques
• [4] Pyrosequencing of Antibiotic-Contaminated River Sediments Reveals High Levels of Resistance and Gene Transfer Elements, E. Kristiansson et al., 2011, PLoS ONE.
• [5] Origine du slogan "Les antibiotiques c'est pas automatique"
• [6] Le nouveau slogan pour limiter l'usage des antibiotiques
• [7] Teicoplanin inhibits Ebola pseudovirus infection in cell culture, Y. Wang et al. 2015, Antiviral Research.
• [8] Inhibition of the Self-cleavage Reaction of the Human Hepatitis Delta Virus Ribozyme by Antibiotics, J. Rogers et al., 1996, Journal of Molecular Biology
• [9] Dissemination of Antimicrobial Resistance in Microbial Ecosystems through Horizontal Gene Transfer, C. J. H. von Wintersdorff et al., 2016, Frontiers in Microbiology.
• [10] Procedure de prescription d'un antibiotique vulgarisée
• [11] The potential of whole genome NGS for infectious disease diagnosis, M. Lecuit et al., 2015, Expert Review of Molecular Diagnostics.
• [12] Rapid metagenomic identification of viral pathogens in clinical samples by real-time nanopore sequencing analysis, A. L. Greninger et al., 2015, BMC Genome Medicine.
• [13] A cloud-compatible bioinformatics pipeline for ultrarapid pathogen identification from next-generation sequencing of clinical samples, S. N. Naccache et al. 2014, Genome Research.
• [14] Kraken: ultrafast metagenomic sequence classification using exact alignments, D. E. Wood et al. 2014, BMC Genome Biology.
• [15] Taxonomer: an interactive metagenomics analysis portal for universal pathogen detection and host mRNA expression profiling, S. Flygare et al., 2016, BMC Genome Biology.
• [16] Understanding, predicting and manipulating the genotypic evolution of antibiotic resistance, A. C. Palmer et al. 2013, Nature Reviews Genetics.
• [17] Consolidating and Exploring Antibiotic Resistance Gene Data Resources, B. B. Xavier et al., 2016, American Society for Microbiology.