Métagénomique et Graphique de Recrutement : chercher l'aiguille dans la botte de foin !

Un inté­rêt cer­tain se déve­loppe pour la com­pré­hen­sion d'écosystèmes com­plexes comme les eaux, les sols ou encore les micro­biomes (plus de 90% des cel­lules du corps humain sont en fait les bac­té­ries qui peuplent son tube diges­tif). Plu­sieurs dif­fi­cul­tés se posent :

1. la plu­part des orga­nismes pré­sents ne sont pas faci­le­ment culti­vables et donc indi­vi­dua­li­sables.
2. tous les orga­nismes ne sont pas pré­sents en quan­ti­té égale et, par exten­sion, d'importance égale dans le fonc­tion­ne­ment de l'écosystème, sans cor­ré­la­tion stricte entre abon­dance et impor­tance.
3. cer­tains de ces éco­sys­tèmes sont extrê­me­ment riches et des cen­taines d'espèces peuvent se cacher dans quelques grammes de ter­reau ou quelques mil­li­litres d'océan.

Face à une tâche aus­si ingrate que pas­sion­nante, les cher­cheurs ont trou­vé une solu­tion dans la célèbre phrase asso­ciée à la Croi­sade des Albi­geois : « Tuez-les tous, Dieu recon­naî­tra les siens », en l'adaptant légè­re­ment :

« Séquen­cez-les tous, un doc­to­rant fera le tri »

Ain­si naquît la Méta­gé­no­mique et de grands pro­jets comme le séquen­çage du rumen des vaches ou du micro­biome humain, le pro­jet METASOIL, le Glo­bal Ocean Sur­vey et plus récem­ment le pro­jet TARA.

Il convient de dis­tin­guer deux pos­si­bi­li­tés en méta­gé­no­mique :

1. séquen­cer un mar­queur géné­tique capable d'identifier les orga­nismes pré­sents à l'échelle du genre voire de l'espèce comme le mar­queur V9 (cor­res­pon­dant à l'ADNr 18S pour les euca­ryotes, 16S pour les pro­ca­ryotes)
2. abu­ser des tech­niques modernes de séquen­çage très haut débit : extraire la tota­li­té des acides nucléiques de l'échantillon, tout décou­per, tout séquen­cer. Pour l'analogie, ima­gi­nons une virée à la Biblio­thèque Natio­nale, un décou­page inten­sif de l'ensemble des pages de cha­cun des livres (dont cer­tains sont ‑au grand bon­heur des nom­breux fans d'Har­ry Pot­ter- en plu­sieurs copies), la réa­li­sa­tion d'un gros tas rela­ti­ve­ment stable, et pour finir se lan­cer, avec espoir, témé­ri­té et un peu de ruban adhé­sif, dans la recons­ti­tu­tion de tous ces chefs d’œuvre (si si, même ceux qu'on n'aime pas, comme 50 Shades of Grey ou la saga Twillight).

Fort heu­reu­se­ment, rares sont les cher­cheurs qui osent se lan­cer en quête d'une com­pré­hen­sion exhaus­tive des popu­la­tions d'un éco­sys­tème com­plexe. Si la quête se révèle rela­ti­ve­ment réa­li­sable lorsqu'on ne séquence qu'un mar­queur uni­ver­sel et qu'il s'agit d'identifier "qui est là", ten­ter de recons­ti­tuer les génomes via une étape d'assemblage se révèle un défi. Bien sou­vent et c'est ce que nous allons abor­der ici, le cher­cheur lamb­da ne s'intéressera qu'à détec­ter l'abondance de son picoeu­ca­ryote ado­ré ou de ses bac­té­ries favo­rites. Pour cela un outil astu­cieux et très pra­tique existe : le Gra­phique de Recru­te­ment (libre­ment tra­duit du Recruit­ment Plot que vous trou­ve­rez dans la lit­té­ra­ture)

L'idée étant sim­ple­ment de recru­ter ‑par ali­gne­ment- des reads de séquen­çage du méta­gé­nome sur un ou plu­sieurs génomes de réfé­rence. Et de dis­tin­guer ces reads par leur pour­cen­tage d'identité avec la séquence cible. Lorsqu'une quan­ti­té signi­fi­ca­tive de reads s'alignent sur le génome d'une souche de réfé­rence, et ce avec un pour­cen­tage d'identité suf­fi­sam­ment impor­tant, on peut émettre l'hypothèse que cet orga­nisme ou une varié­té d'organismes très proches sont pré­sent dans l'échantillon consi­dé­ré.

Ingré­dients de la recette du jour : Le Gra­phique de Recru­te­ment

1. Quelques dizaines de mil­lions de "reads" d'une taille hon­nête (pas moins de 100 paires de bases), au mieux une banque Illu­mi­na "Pair-End" de 2 x 100 pb che­vau­chants voire de longs reads 454 ou Ion­Tor­rent.
2.  Quelques génomes de réfé­rence, repré­sen­ta­tifs de la diver­si­té du groupe dont vous sou­hai­tez détec­ter la pré­sence
3.  Un gros, gros ordi­na­teur (ou bien mieux un clus­ter de cal­cul)
4. Quelques com­pé­tences en "lan­çage de BLAST" et dans un lan­gage de pro­gram­ma­tion "User Friend­ly" (type Bash, Python ou Perl) ain­si qu'un peu de R pour faire de beaux gra­phiques, mais Excel reste uti­li­sable pour les fri­leux
5. Beau­coup d'enthousiasme !

Dif­fi­cul­té : 3 /​ 5     Rien d'extravagant ici, mais néces­site une cer­taine sou­plesse devant une ligne de com­mande

Méthode en 3 étapes :

1/​ Ali­gner l'ensemble des reads du méta­gé­nome sur l'ensemble des génomes "de réfé­rence" à l'aide de BLAST, en auto­ri­sant des "hits" aus­si faibles que 55% d'identité

L'idée étant de trou­ver les para­mètres appro­priés :

Avec ‑W 8 : la taille du "mot", ‑G 8 ‑E 6 ‑r 5 ‑q 4 : les coûts d'ouverture et d'élongation de gap, la récom­pense pour un match et la péna­li­té pour un mis­match,

: quelques filtres pour allé­ger les fichiers de sor­tie, et non moins impor­tant ‑m 8 pour une sor­tie tabu­lée facile à mani­pu­ler. Ces para­mètres ne sont qu'une sug­ges­tion, il convien­dra de les adap­ter à ses propres don­nées.

2/​ Net­toyer les résul­tats (à l'aide de Bash, Python ou Perl, ou autre…)

Il s'agit de conser­ver les hits BLAST qui vous semblent per­ti­nents, non pas en termes de pour­cen­tage d'identité, mais en terme de lon­gueur de l'alignement. J'essaye par exemple d'avoir au moins 80% de la séquence de mon read qui soit effec­ti­ve­ment ali­gnée. À ce stade, vous vou­lez savoir si un orga­nisme de réfé­rence don­né est pré­sent dans le méta­gé­nome. Il ne s'agit pas de faire de com­pé­ti­tion entre vos orga­nismes de réfé­rence, je vous sug­gère donc de conser­ver éga­le­ment l'information de reads qui s'alignent sur plu­sieurs de vos génomes (en l'occurence, consi­dé­rant que vos génomes sont proches, cela devrait se pro­duire régu­liè­re­ment). Par contre, n'hésitez pas à ne conser­ver que le meilleur hit de chaque read pour cha­cune de  vos souches de réfé­rence.

Il s'agit ensuite d'extraire trois infor­ma­tions clefs : le génome de réfé­rence où le read s'est ali­gné, le pour­cen­tage d'identité du hit et la loca­li­sa­tion de ce hit sur le génome de réfé­rence (pas de pitié, faites la moyenne du Stop et du Start).

3/​ Construc­tion du Gra­phique de Recru­te­ment

Il s'agit enfin, pour un orga­nisme de réfé­rence don­né de géné­rer le gra­phique sui­vant : en abs­cisse la posi­tion sur le chro­mo­some de votre orga­nisme (s'il y en a plu­sieurs, il fau­dra faire plu­sieurs graphes ou bien les conca­té­ner), et en ordon­née, pour cha­cun des reads son pour­cen­tage d'identité. Petit conseil : il n'est pas utile d'afficher 2 mil­lions de points sur un gra­phiques, sélec­tion­nez tout au plus 100 000 points à affi­cher.

Résul­tats :

Gra­phique de Recru­te­ment pour la Souche A (G.Farrant, Tous droits réser­vés)

Gra­phique de Recru­te­ment pour la Souche B (G.Farrant, Tous droits réser­vés)

Dans ces exemples, j'ai fusion­né les pro­fils de recru­te­ment des méta­gé­nomes de trois sta­tions de pré­lè­ve­ment sur les génomes de deux souches bac­té­riennes A et B. Cette com­bi­nai­son de 3 condi­tions, asso­ciées à des cou­leurs dif­fé­rentes faci­lite la com­pa­rai­son des sta­tions. L'histogramme à droite du gra­phique repré­sente l'abondance de points sur des tranches de pour­cen­tage d'identité.

On observe que qua­si­ment aucun read ne s’aligne sur la souche A avec une iden­ti­té supé­rieure à 90% alors que sur la souche B, une quan­ti­té signi­fi­ca­tive de reads s’aligne avec plus de 90% d’identité, ce qui per­met de conclure que des orga­nismes géné­ti­que­ment proches de la souche B sont pré­sents dans l’échantillon étu­dié. Les points recru­tés entre 55 et 80% d'identité cor­res­pon­draient à du recru­te­ment non-spé­ci­fique.

On observe éga­le­ment quelques arte­facts poten­tiel­le­ment inté­res­sants tels des sites où le signal est très riche, l'intuition amène à pen­ser qu'il s'agit de régions conte­nant des gènes de ménage lar­ge­ment conser­vés entre orga­nismes (type ARN ribo­so­miques) ain­si que des régions "vides", dont une très mar­quée pour la Souche 2, qui doivent être inter­pré­tés (îlots géno­miques ?).

Le Gra­phique de Recru­te­ment est un pre­mier outil d'analyse de la pré­sence d'organismes de réfé­rence dans un méta­gé­nome. Il per­met entre autres de défi­nir un seuil de pour­cen­tage d'identité prompt à dis­cri­mi­ner les familles d'organismes. Il per­met éga­le­ment de révé­ler des par­ti­cu­la­ri­tés riches d'interprétations. Pour plus d'infos et du sub­ti­li­tés, je vous sug­gère la publi­ca­tion du Glo­ba­lO­cean­Sur­vey (GOS) qui s'octroie la pater­ni­té de la méthode.

Je tiens à remer­cier Mali­cia, Haut­bit, Yoann M., Nico M., Mica et Guillaume Col­let pour leurs com­men­taires avi­sés.